தன்-இணைவு
தன்-இணைவு (self ligation) என்பது மூலக்கூற்று உயிரியலின் பக்டிரியல் படிவாக்கம் செய்யும் நுட்பத்தில் பயன்படுத்தப்படும் ஒருசொல் ஆகும். இம்முறையில் பாவிக்கப்படும் கட்டுள்ள நொதிகளை பொருத்து இரு வகையான படிவாக்கம் உள்ளன.
- ஒற்று முனை படிவாக்கம் (blunt end cloning)
- ஒற்றற்ற அல்லது நீட்சி முனை படிவாக்கம் (sticky end cloning)
ஒற்று முனை படிவாக்கம்
இப்படிவாக்கத்தின் போது ஆய்வாளர்கள் தன்-இணைவு என்னும் பிரச்சினையெய் அல்லது சிக்கலை எதிர்கொள்வார்கள். ஒற்று முனை படிவாக்கத்தின் போது மிகையான தன் இணைவு இருக்கும். மேலும் நாம் தேர்ந்தெடுக்கும் கட்டுள்ள நொதி செயலை பொருத்து தன் இணைவு அமையும். நொதி தளர்வான முறையில் (குறை செரிமானம்) (partial digestion) இருந்தால், செரிமானம் அடையாத முழு பரப்பிகள் வெகு எளிதாக இ.கோலி (E.coli) கலத்தில் உள் சென்று விடும். இதனால் பல பல்கலன்களை (colony) தேர்ந்தெடுத்து நாம் விரும்பும் டி.என்.ஏ உள்ளதா என அறிய வேண்டும். சில வேளைகளில் டி.என்.ஏ இணையாமால் வெறும் நாம் பயன்படுத்திய பரப்பி மட்டும் இ.கோலி யில் உள் சென்றிருக்கும்.
இவ்விடத்தில் ஏன் நேராக்கப்பட்ட அல்லது நொதியால் வெட்டப்பட்ட பரப்பிகள் இ.கோலி. கலத்தில் உள் நுழையாதா? என்ற வினா எழுகிறது அல்லவா. ஒரு நேரான கயிறையும், நன்கு சுற்றப்பட்ட வட்ட வடிவிலான கயிறையும் நினைவில் கொள்ளுங்கள். இவ்விரு கயிறையும் நீரில் வீசினால், எவ்வொன்று துரிதமாக ஆழத்தில் சென்று தரையெய் அடையும் என்பதை கவனியுங்கள். நன்றாக சுற்றப்பட்ட கயிர் விரைவில் தரையில் சேரும், ஏனெனில் அவைகள் நேர்த்தியாக சுற்றப்பட்டு கனமாக இருக்கும். மாறாக நேரான கயிர் நீரில் மிதக்கும். வெட்டப்பட்ட நேரான பரப்பிகள் தன் இணைவு அல்லது நாம் விரும்பும் டி.என்.ஏ வோடு இணைந்து வட்ட வடிவமானால் எளிதாக இ.கோலியில் செல்லும். மாறாக நேராக இருந்தால் அவைகளால் உள் நுழைய முடியாது.
தடுக்கும் முறை
இதை தவிர்ப்பதற்கு கட்டுள்ள நொதிகளால் வெட்டப்பட்ட பரப்பிகளில் பாசுபடசு (Phosphatase) என்னும் நொதியால் பாசுபேட் (Phosphate) குழுவை நீக்கி விட வேண்டும். இதனால் தன் இணைவு குறைக்கப்பட்டு, படிவாக்கம் செய்வதற்கான நிகழ்தகவு மிகையாக்கப்படுகின்றன.
பொதுவாக ஒற்று முனையெய் உருவாக்கும் கட்டுள்ள நொதிகளின் (எ.கா. EcoRV, SmaI, HpaI,HincII ) வெட்டும் இடத்தில் படிவாக்கம் நிகழும்போது, அவ் நொதிகளின் வெட்டும் வரிசைகள் இழக்கப்படும். அதாவது நாம் படிவாக்கம் செய்ய விரும்பும் மரபணு அல்லது டி.என்.ஏ வரிசைகள் இணையும் போது , கட்டுள்ள நொதிகளின் வெட்டும் வரிசைகளில் மாற்றம் ஏற்படுவதால், மறுபடியும் அவ் நொதிகளை கொண்டு டி.என்.ஏ க்களை செரிமானம் செய்ய இயலாது.
இணைவு நிகழ்வின் போது, இணைவி நொதிகளின் (DNA Ligase) இடையே கட்டுள்ள நொதியும் கூடுதலாக சேர்த்தால், தன்-இணைவால் சேரும் பரப்பிகளை கட்டுள்ள நொதியின் செரிமனத்தால் தன்-இணைவு சிக்கலை தவிர்க்கலாம். இவ்விடத்தில் நாம் படிவாக்கம் செய்ய விரும்பும் டி.என்.ஏ வரிசையில், மேற்கூறிய நிகழ்வில் பயன்படும் கட்டுள்ள நொதியின் வெட்டும் வரிசைகள் இல்லமால் இருக்க வேண்டும்.
ஒற்றற்ற அல்லது நீட்சி முனை படிவாக்கம்:
இம்முறையில் தன்-இணைவுக்கான நிகழ்தகவு குறைவு. மேலும் இம்முறையில் நாம் விரும்பிய மரபணுவை, தொடரியெய் (Promoters) பொருந்து, நாம் விரும்பும் வழிகளில் (நேரான அல்லது தலைகீழ், orientation, sense or anti sense ) படிவாக்கம் செய்யலாம். இம்முறையில் ஒரு கட்டுள்ள நொதி குறை செரிமானத்தை (partial digestion) வெளிப்படுத்தினால் தன் இணைவு மிகையாக இருக்கும். நாம் தேர்தெடுக்கும் இரு கட்டுள்ள நொதிகளின் வரிசை வெகு அருகே இருந்தால் (adjacent sites), நொதிகளின் செரிமானத்தின் நேரத்தை (incubation time) கூட்ட வேண்டும்.